CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，具体介绍请参考：http://www.sciencemag.org/content/339/6121/819；http://www.genome-engineering.org/crispr/。
以下操作说明是基于作者个人实验室，仅供参考。本说明纯手工打造，如有雷同，纯属巧合。
质粒介绍我们使用的是Feng Zhang 实验室的系统，简介如下：
我们使用的是pX330 质粒，详细的信息请见https://www.addgene.org/42230/。
酶切系统37 ℃, 3hr；Run 1% gel，回收。Elute 到50 ml H2O。
我们利用BbsI消化载体形成粘末端，以利于下游oligo退火产物的连接；
酶切时请充分，且绝对不能加CIP处理。
Target设计Target设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到NGG（N代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游20 nt即可 （如上图）。
目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全KO一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas系统诱导产生indel）。所以我们一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域。另外，通常一个基因往往会转录成2个以上的isoforms，所以请选择尽量靠近5’端的公共部分，保证每个isoform都会成功移码突变。
通常情况下，为了便于下游KO mutants的鉴定，我们往往可以作如上设计：即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少100 bp内酶切位点唯一。
为了减少Off-Target效应，请把设计好的Target放在括号中的网址里去做预测，尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验（http://crispr.mit.edu ）。
20 nt确定之后，请按照如上图所示合成两条配对的普通oligo即可。请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。
克隆构建1. Annealing Oligos
2. Ligation
3. Transformation and pick up clones for seq.
4. Midi-prepare plasmid for transfection.
Validate target的编辑效率单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）（CHO、293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用）。如果编辑效率50%，推荐分两块plate即可，最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系；或者铺到100 mm dish里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如SV589等，但是挑取的单克隆往往不纯，有时需要重新亚克隆）。
单克隆的鉴定根据设计，推荐使用酶切鉴定的方法（见设计部分），通量高；如果抗体比较好用，推荐使用WB检测蛋白，这种方法最彻底；最末一种方法就是直接测序鉴定，该种方法费时费力费钱，建议设计时尽量避开。
PS: Feng Zhang lab后来推出lentivirus版本的Cas9质粒系统(lentiCRISPR v2)。这个系统设计起来和pX330一样，但克隆构建使用的酶切位点不同。请注意参考addgene在线protocol：https://www.addgene.org/static/data/plasmids/52/52961/52961-attachment_B3xTwla0bkYD.pdf
本文链接： http://kpl.immuno-online.com/view-1467440181.html
